Фермент «прыгающий ген» может вносить большие и точные изменения в ДНК человека

Благодаря CRISPR и связанным с ним методам редактирования генов ученые все лучше и лучше справляются с внесением небольших изменений в нашу ДНК для лечения определенных заболеваний. Но они все еще работают над тем, как вставлять длинные участки ДНК в точные места в геноме человека — подвиг, который мог бы расширить спектр состояний, поддающихся лечению с помощью редактирования. 

Теперь исследовательская группа повысила эффективность набора молекулярных инструментов, связанных с CRISPR, заимствованных из бактериальных клеток. В статье в Science они сообщают, что использовали эти инструменты для установки сегментов ДНК размером с целые гены в человеческие клетки. Результат может облегчить превращение этой бактериальной системы в практическое лечение заболеваний, говорят ученые, хотя и маячат некоторые серьезные технические проблемы.

«Был огромный интерес к размещению больших фрагментов ДНК», — говорит иммунолог Димитриос Вагнер из Медицинского колледжа Бейлора, который разрабатывал методы редактирования геномов иммунных клеток и не был связан с исследованием. Работа «является важным шагом на пути к улучшению технологии».

Методика вставки больших кусков ДНК в определенных местах может ускорить разработку методов лечения таких заболеваний, как кистозный фиброз и гемофилия B, которые возникают в результате различных мутаций. Например, при кистозном фиброзе было обнаружено более 2000 дефектов ДНК. Если бы исследователи могли вставить целый исправленный ген, они могли бы разработать единую терапию для многих мутаций. Им не пришлось бы разрабатывать, тестировать и получать одобрение регулирующих органов для индивидуального лечения, которое устраняло бы каждый сбой генома, как персонализированное исправление, о котором сообщалось ранее сегодня для ребенка с ферментным расстройством. Технологии вставки генов также могут позволить ученым улучшить химерные антигенные рецепторы Т-клеток, генетически измененные иммунные клетки, которые борются с раком.

Проблема в том, как это сделать. Генная терапия часто полагается на ручные вирусы для переноса полноразмерных генов в клетки. Но этот подход неточен. Добавленные гены попадают в случайные места в геноме или могут вообще не попасть в него. Напротив, точность является отличительной чертой методов редактирования генов, таких как CRISPR, который был одобрен для лечения серповидноклеточной анемии и тестируется против ряда других заболеваний, и редактирования оснований, ответвления CRISPR, которое заменяет проблемные основания ДНК и также вошло в клинические испытания. Такие методы хорошо работают для изменений менее 200 оснований, но человеческие гены, как правило, имеют длину в тысячи оснований. Еще одним ограничением традиционных систем CRISPR является то, что они оставляют разрывы в обеих цепях ДНК в месте редактирования, что может привести к вредным последствиям, таким как потеря или приобретение генетического материала.

Вместо этого новая работа опирается на ферменты, называемые CRISPR-ассоциированными транспозазами, или CAST, которые могут вставлять ДНК, не создавая этих двухцепочечных разрывов. В бактериальных клетках CAST помогают паразитическим последовательностям ДНК, известным как транспозоны, перескакивать с места на место в геноме. Направляющая РНК-цепь в ферментах указывает, куда вставлять кочевые последовательности.

Предыдущие исследования определили, что CAST почти на 100% эффективны при втискивании кусков ДНК в целевые места в бактериальных геномах. Но они не справились с человеческими клетками. Например, в прошлом году биохимик Сэмюэль Стернберг из Колумбийского университета и его коллеги сообщили, что эффективность процесса составила всего около 0,1%.

Чтобы улучшить подход, лаборатория Стернберга объединила усилия с командой под руководством виртуоза редактирования генома Дэвида Лю, химического биолога из Гарвардского университета и Института Брода. Трудно разрабатывать улучшения для такой сложной системы, как CAST, поэтому команда обратилась к искусственной эволюционной системе, содержащей бактерии и их вирусных паразитов, которую разработала лаборатория Лю. Исследователи вставили последовательности для некоторых белков CAST в геномы вирусов. Для того чтобы патогены могли размножаться, их CAST должны были манипулировать ДНК бактерий, активируя ген в микробах, который обеспечивает репликацию вируса.

Случайная мутация вирусов дала пищу для естественного отбора, чтобы развить штаммы, чьи белки CAST были наиболее эффективны в создании сдвигов и вставок в ДНК их хозяев. Такой подход ускоряет скорость естественной эволюции в 1000 раз, говорит Лю. «Это то, что мы использовали, чтобы решить проблему».

После того, как компоненты CAST эволюционировали в течение сотен вирусных поколений, исследователи доработали их, а затем провели испытания системы на различных линиях человеческих клеток. Эксперименты показали, что обновленная система работала примерно в 200 раз лучше оригинала, с эффективностью, которая обычно составляла от 10% до 30%. Исследователи также показали на человеческих клетках, что обновленные CAST могут вносить изменения, которые могут быть клинически значимыми, например, вставлять ген для белка свертывания крови, известного как фактор IX, который является дефектным при гемофилии B.

В статье впервые продемонстрировано, что CAST могут вставлять большие фрагменты ДНК «на заметных уровнях в клетки человека», и это «устанавливает флаг» эффективности подхода, говорит молекулярный генетик Шондра Миллер из Детской исследовательской больницы Св. Иуды. Стэнли Ци, биоинженер из Стэнфордского университета, похвалил «впечатляющую работу» команды в области направленной эволюции ключевых белковых компонентов.

Исследование «является проявлением силы в плане инженерии», говорит исследователь генной терапии Луиджи Налдини из Медицинской школы Университета Сан-Раффаэле, но «еще предстоит пройти долгий путь для клинического применения». CAST относительно большие, что может затруднить их введение в клетки пациента. Доставка CAST в нужные ткани организма также может быть сложной. И Лю отмечает, что исследователям, возможно, придется бороться с естественной защитой клеток от патогенов. «Многие клетки возражают против того, чтобы в них вставляли большие фрагменты ДНК. Они думают, что подвергаются вирусной атаке».

Ученые разрабатывают другие методы добавления больших фрагментов ДНК в геном человека, включая метод, известный как PASSIGE, который Лю и его коллеги представили в 2021 году, который основан на ферментах обмена ДНК, называемых рекомбиназами, вместо CAST. «Слишком рано говорить о том, какая технология будет лучшей», — говорит Стернберг. Но теперь у исследователей «есть возможность сравнить их лицом к лицу».